Nghiên cứu của các nhà khoa học Ai Cập đã cho thấy hiệu quả sử dụng kháng sinh florfenicol giúp loại bỏ hầu hết các thông số miễn dịch cũng như tải lượng mầm bệnh ở tôm nhiễm vi khuẩn Vibrio.
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Tôm bố mẹ bị bệnh (trọng lượng cơ thể 45,68 g ± 0,18 g) được thu thập ngẫu nhiên từ ba ao lớn (100 con mỗi ao, 3m x 8m x 1m) đặt trong một trại sản xuất tôm giống ở DTZ, Damietta-Port-Said, Ai Cập. Những ao này được phân loại là bị nhiễm bệnh, tỷ lệ tôm chết cao (55%), tôm có hành vi bơi lờ đờ và tắc nghẽn ở hầu hết các bộ phận phụ của cơ thể và vỏ với sự đổi màu nâu và xuất huyết của gan tụy (HP). Thức ăn được dùng với 5% tổng trọng lượng cơ thể tôm. Các thông số chất lượng nước, như amoniac (mg/L), nhiệt độ (°C), oxy hòa tan (mg/L) và độ mặn (‰) với giá trị pH, được theo dõi hàng ngày.
Các mẫu tôm (10 cá thể có dấu hiệu sắp chết ngẫu nhiên/ao) được vận chuyển từ trại giống đến các cơ sở nghiên cứu của Phòng thí nghiệm quản lý và bệnh cá, Khoa Thú y, Đại học Mansoura, với khoảng thời gian tối đa là 2 giờ. Các túi polyetylen chứa đầy nước biển (1/3) và oxy (2/3) trước khi niêm phong được sử dụng để vận chuyển tôm. Việc lấy mẫu tôm bệnh được thực hiện trong vòng hai ngày kể từ khi dịch bệnh bùng phát.
Đầu tiên, lượng tan máu 100 µL (n=6) được thu thập từ xoang bụng thông qua một ống tiêm được đổ sẵn 500 µL dung dịch đệm chống đông máu để đánh giá tổng số lượng tế bào máu, quá trình thực bào và hoạt động bùng nổ hô hấp. Một mẫu tan máu khác (100 µL) được thu thập riêng lẻ từ mỗi con tôm trong các ao khác nhau, được bảo quản ở 4°C trong 12 giờ, sau đó ly tâm 4.000 vòng/phút trong 10 phút. Chất nổi phía trên được thu thập và giữ ở -80°C cho đến khi mang đi phân tích sâu hơn về hoạt động của enzyme, chỉ số chống oxy hóa và các thông số miễn dịch. Gan tụy tôm (HP) từ ba nhóm được thử nghiệm vô trùng để phân lập vi khuẩn và sau đó được giải phẫu cẩn thận và được bảo quản ở -80°C để phân tích biểu hiện gen.
Các chỉ tiêu được phân tích trong nghiên cứu này bao gồm: tính mẫn cảm của các chủng Vibrio gây bệnh với kháng sinh, kiểm soát thử nghiệm nhiễm Vibrio bằng ứng dụng kháng sinh, tổng số lượng tế bào máu, hoạt động của enzyme và chỉ số chống oxy hóa, đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu,…
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
Dấu hiệu lâm sàng của tôm bệnh
So với tôm khỏe mạnh, gan tụy và cơ thể của tôm bệnh có màu đỏ đáng kể và lờ đờ, gan tụy biểu hiện xuất huyết, chấm xuất huyết ở cơ bụng cơ thể và vỏ có màu đỏ (Hình 1A). Ngoài ra, xuất hiện các đốm màu đỏ trên vỏ, chân tôm (Hình 1B).
Hình 1. (A): Các trường hợp tôm giống bố mẹ bình thường và bị nhiễm bệnh (B): Tôm bị nhiễm bệnh có sự đổi màu đỏ ở cơ bụng, gan tụy và vỏ, với một vùng hắc tố trên lớp biểu bì bụng màu đỏ (mũi tên). Các đốm màu đỏ được hiển thị trên vỏ với các đốm đỏ (mũi tên).
Đặc tính của các chủng vi khuẩn Vibrio
Tổng cộng có 45 chủng vi khuẩn Vibrio spp. thu được từ tôm bị bệnh dựa trên đặc điểm hình thái và sinh hóa của vi khuẩn. Hệ thống định danh API 20E đã sắp xếp các chủng phân lập thành V. atlanticus (5 chủng), V. natriegens (7 chủng), V. alginolyticus (15 chủng) và V. harveyi (18 chủng). Giám định PCR của các chủng vi khuẩn sử dụng mồi Vibrio 16S rRNA cho thấy các dải khuếch đại có kích thước 663bp, đặc trưng của vi khuẩn Vibrio spp.
Phân tích tính mẫn cảm của các chủng Vibrio gây bệnh với kháng sinh
Các chủng vi khuẩn Vibrio rất nhạy cảm với chloramphenicol, doxycycline và florfenicol nhưng lại kháng amoxicillin. Các chủng này thể hiện độ nhạy vừa phải với norfloxacin. Chủng Vibrio khác nhạy cảm vừa phải với erythromycin và ciprofloxacin; tuy nhiên, chủng khác cho kết quả không giống nhau (Bảng 1). Tỷ lệ chết tích lũy ban đầu được ước tính là khoảng 55% vào ngày đầu tiên, tỷ lệ này tiếp tục ở mức phần trăm tương tự trong năm ngày liên tiếp. Sau đó, ứng dụng FLO đã giảm tỷ lệ chết tích lũy xuống 20% đối với tôm được dùng thuốc. Không có tôm bố mẹ bị chết (nhóm đối chứng) không bị nhiễm bệnh.
Bảng 1. Mức độ mẫn cảm của hai chủng Vibrio gây bệnh với kháng sinh qua kết quả xét nghiệm kháng sinh đồ
Tổng số tế bào máu
Tổng số tế bào máu (THC), tế bào hạt (GC), tế bào bán hạt (SGC) và tế bào hyaline (HC) của tất cả các nhóm thử nghiệm được trình bày trong Hình 2. Nhóm bị nhiễm Vibrio cho thấy THC giảm đáng kể. Tuy nhiên, việc điều trị tôm bị nhiễm bệnh bằng florfenicol đã phục hồi đáng kể tổng số lượng tế bào máu được tính vào mức bình thường, so với nhóm bị nhiễm bệnh (Hình 2).
Hình 2. Tổng số tế bào máu (THC; (A)), tế bào hạt (GC; (B)), tế bào bán hạt (SGC; (C)) và tế bào hyaline (HC; (D)) của tôm bị nhiễm Vibrio spp. và nhóm được điều trị bằng kháng sinh florfenicol.
Hoạt động của enzyme và chỉ số chống oxy hóa
ALT, AST, ALP và ACP tăng đáng kể ở tôm bị nhiễm Vibrio spp. so với đối chứng. Trong khi đó, các hoạt độ enzyme trước đó ALT, AST, ALP và ACP được tái lập đáng kể ở nhóm được điều trị bằng kháng sinh so với nhóm bị nhiễm bệnh.
Các thông số miễn dịch
Tỷ lệ% thực bào, bùng nổ hô hấp và diệt khuẩn trong hoạt động của tôm được điều trị bằng florfenicol tăng đáng kể so với tôm bị nhiễm Vibrio, điều này thể hiện sự ức chế đáng kể trong các phản ứng miễn dịch khác nhau.
Sự biểu hiện của LvHc, LvToll1 và LvproPO
Mức độ phiên mã của gen LvproPO và LvToll1 trong gan tụy không khác biệt về mặt thống kê giữa các nhóm, mặc dù mức độ biểu hiện thấp hơn đã được quan sát thấy ở các nhóm bị nhiễm bệnh và được điều trị so với nhóm đối chứng. Tương tự, biểu hiện mRNA của LvHc trong gan tụy được điều hòa giảm rõ rệt ở nhóm được điều trị khi so sánh với nhóm đối chứng và nhóm nhiễm bệnh.
QUAN ĐIỂM
Bốn chủng vi khuẩn Vibrio đã được phân lập trong nghiên cứu này từ gan tụy của tôm nhiễm bệnh ở trại giống Ai Cập. Việc bổ sung FLO giúp loại bỏ hầu hết các thông số miễn dịch cũng như tải lượng mầm bệnh ở tôm nhiễm bệnh. Ở đây, dữ liệu của các tác giả có thể đánh giá sàng lọc miễn dịch đối với tôm bệnh trong trại giống để chỉ ra tác dụng của thuốc kháng sinh trong việc quản lý và kiểm soát bệnh Vibrio thông qua việc lấy lại phản ứng miễn dịch của tôm sau khi kháng sinh loại bỏ nhiễm trùng thay vì phản ứng trực tiếp. Tuy nhiên, vẫn cần tiến hành điều tra và thăm dò thêm về chất lượng và việc sử dụng kháng sinh trong nuôi tôm.
ThS. Chinh Lê (Lược dịch)
Học viện Nông nghiệp Việt Nam
English