Dữ liệu proteomic cho rằng, nhiễm EHP gây ra các con đường truyền tín hiệu apoptotic liên quan đến caspase 3 trên tôm thẻ chân trắng.
Caspase 3 liên quan đến con đường truyền tín hiệu apoptotic khi tôm nhiễm EHP
Các nhà khoa học đã chỉ ra rằng EHP lây nhiễm vào gan tụy, cơ quan miễn dịch quan trọng của tôm. Do đó, nhiễm EHP có thể dẫn đến rối loạn hoạt động của hệ thống miễn dịch. Tuy nhiên, có rất ít dữ liệu, đặc biệt là ở cấp độ proteomics, về phản ứng miễn dịch của tôm thẻ chân trắng đối với nhiễm EHP. Caspase 3 đóng vai trò then chốt trong việc kích hoạt quá trình apoptosis (quá trình của sự chết tế bào được lập trình xảy ra trong các sinh vật đa bào), nên caspase 3 đã thực hiện việc ký sinh trùng tiêu diệt tế bào chủ và các tế bào thiếu caspase-3 có khả năng chống lại quá trình apoptosis.
Trong nghiên cứu này, các protein được biểu hiện khác nhau (DEP) giữa tôm bị nhiễm EHP và tôm không bị nhiễm bệnh đã được nghiên cứu thông qua giải trình tự proteomics. Tổng cộng có 9908 peptide và 2092 protein đã được xác định. Tổng cộng có 69 DEP được xác định trong gan tụy (HP), trong đó, 28 chất được điều chỉnh tăng và 41 chất được điều chỉnh giảm.
Theo đó, tổng cộng 297.696 phổ thứ cấp thu được từ phân tích MS, trong đó, 18.644 phổ khối có sẵn đã được xác định trong cơ sở dữ liệu protein với tỷ lệ sử dụng là 6,26%. Tổng cộng có 9908 peptide và 2092 protein đã được xác định trong phân tích quang phổ. Kết quả phân tích cụm và thành phần chính (PCA) của các nhóm khác nhau cho thấy các protein trong nhóm điều trị và nhóm kiểm soát được phân biệt dễ dàng. Hơn nữa, phân tích chức năng COG cho thấy 2092 protein được phân loại thành 25 quá trình sinh học; trong đó năm yếu tố hàng đầu bao gồm sửa đổi sau dịch mã, luân chuyển protein, người đi kèm, chỉ dự đoán chức năng chung, cơ chế truyền tín hiệu, vận chuyển và chuyển hóa lipid cũng như sản xuất và chuyển đổi năng lượng, cho thấy các phản ứng miễn dịch do nhiễm EHP của gan tụy có thể ảnh hưởng đến cường độ truyền tín hiệu.
Tổng cộng có 69 DEP đã được xác định (p<0,05), trong đó 41 DEP được điều chỉnh tăng đáng kể và 28 DEP được điều chỉnh giảm đáng kể sau thử thách EHP. Kết quả phân cụm cho thấy, các DEP trong nhóm điều trị và kiểm soát dễ dàng phân biệt và phân nhóm. Bản đồ núi lửa phù hợp với kết quả bản đồ nhiệt.
Quá trình làm giàu GO cho thấy rằng các quá trình sinh học của DEP chủ yếu được làm giàu trong quá trình dị hóa peptide, phân giải protein, xáo trộn phospholipid màng plasma và quá trình chuyển hóa carnitine. Các thành phần tế bào của DEP chủ yếu được làm giàu trong không gian ngoại bào, màng sinh chất, tế bào chất, mạng lưới nội chất và màng. Hoạt tính metallicoaminopeptidase, hoạt tính phospholipid scramblase, hoạt tính vận chuyển lipid, hoạt tính oxyoreductase và liên kết peptide là các chức năng phân tử chính của DEP được làm giàu trong nghiên cứu này.
Một phân tích KEGG đã được sử dụng ở đây để xác định các lộ trình DEP. Kết quả cho thấy lysosome, chuyển hóa đường amin, chuyển hóa đường nucleotide, chuyển hóa beta-alanine, chuyển hóa tyrosine và thoái hóa glycosaminoglycan là những con đường quan trọng của DEP được điều hòa. Chuyển hóa Glycerophospholipid, chuyển hóa retinol, peroxisome, thoái hóa axit béo và chuyển hóa purine là những con đường quan trọng của DEP được điều hòa giảm.
Mức độ biểu hiện khác nhau của các protein liên quan đến quá trình apoptosis đã được tìm thấy trong gan tụy của tôm thẻ chân trắng (Hình 1). Kết quả của nghiên cứu cho thấy rằng sau khi chuẩn hóa các mẫu ba lần, mức độ biểu hiện của gen caspase 3 đã được điều chỉnh tăng trong gan tụy của tôm bị nhiễm EHP (Hình 1). Trong số các protein được biểu hiện khác nhau, nhóm nghiên cứu nhận thấy rằng biểu hiện của protein liên quan đến quá trình tự hủy được điều chỉnh tăng đáng kể sau khi lây nhiễm EHP (Hình 1). Vì dấu hiệu sinh hóa được công nhận nhất của các giai đoạn khác nhau của quá trình chết theo chương trình là kích hoạt cysteine protease (caspase), việc phát hiện caspase-3 hoạt động trong tế bào và mô là một phương pháp quan trọng để phân tích các tín hiệu chết theo quá trình apoptosis. Các nhà nghiên cứu trước đây đã phát hiện ra rằng kích hoạt caspase-3 phụ thuộc vào bax là yếu tố chính quyết định quá trình chết theo chương trình do p53 gây ra. Ở cấp độ protein, sự gia tăng protein Bax prooptotic và kích hoạt caspase-3 sau khi nhiễm EHP đã được tìm thấy trong nghiên cứu này (Hình 1). Yếu tố gây ra quá trình chết theo chương trình là một protein flavin liên màng ty thể được bảo tồn về mặt phát sinh gen, gây ra quá trình chết theo chương trình thông qua một con đường độc lập với caspase. Mức độ biểu hiện của các protein trên liên quan đến quá trình chết theo apoptosis (Caspase 3: 2,52 lần, Bax: 1,42 lần và yếu tố gây chết tế bào chết theo chương trình 3: 1,17 lần) đã tăng đáng kể sau khi nhiễm EHP (Hình 1).
Hình 1. Mức độ biểu hiện của protein caspase 3, Bax và yếu tố gây chết tế bào thứ 3 trong con đường gây chết tế bào theo apoptosis ở mô gan tụy tôm của tôm nhiễm hoặc không nhiễm EHP.
Trong nghiên cứu này, phân tích họa tiết cho thấy caspase 3 trong số 10 loài được tìm thấy 3 họa tiết–5 (Hình 2a), trong đó tôm thẻ chân trắng và tôm sú có 3 họa tiết cùng loại và họa tiết ở đầu 3′ ở các họa tiết này 10 loài hoàn toàn giống nhau (Hình 2a). Kết quả cho thấy rằng, một trung tâm hoạt động, bao gồm 12 peptide “KPKL XXIQ ACRG” là một mô típ được bảo tồn trong số 10 loài (Hình 2b). Axit amin thứ năm ở trung tâm hoạt động là “Y” ở tôm kém tiến hóa, trong khi ở các loài khác là “F” (Hình 2b). Axit amin thứ sáu của trung tâm hoạt động là “I” ở người và chuột tiến hóa cao hơn, trong khi ở các loài khác là “F” (Hình 2b). Cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động trong caspase 3 cho thấy tính đa hình axit amin đơn trong vùng này ảnh hưởng đến chức năng của protein caspase 3 ở tôm thẻ chân trắng (Hình 2c).
Hình 2. Dự đoán mô-đun trình tự và trung tâm hoạt động protein của caspase 3
(a) Mô-đun của caspase 3 protein từ 10 loài, các màu khác nhau đại diện cho các loại mô-đun khác nhau. (b) Căn chỉnh trình tự của caspase 3 vị trí hoạt động từ mười loài, các màu khác nhau ở cùng một vị trí biểu thị tính đa hình axit amin đơn. (c) Cấu trúc không gian của trung tâm hoạt động của caspase tôm thẻ chân trắng 3.
Tóm lại, ảnh hưởng của nhiễm EHP đối với phản ứng của gan tụy của tôm thẻ chân trắng ở cấp độ proteomic đã được làm rõ ở nghiên cứu này. Dữ liệu hệ protein của nghiên cứu này hỗ trợ cho các nghiên cứu tiếp theo về tác động của việc nhiễm EHP đối với tôm thẻ chân trắng. Dữ liệu proteomic cho rằng nhiễm EHP gây ra các con đường truyền tín hiệu apoptotic liên quan đến caspase 3. Sau đó, các chuỗi cDNA và axit amin có độ dài đầy đủ của caspase 3 ở tôm chân trắng đã được xác định tương ứng từ bộ gen tôm chân trắng đã công bố và các thư viện hệ protein của chúng tôi. Đặc điểm cấu trúc và chức năng đã được thực hiện, cùng với phân tích các biến thể phiên mã ở tôm khỏe mạnh và tôm bị thách thức về miễn dịch. Nhìn chung, nghiên cứu hiện tại sẽ cung cấp tài liệu tham khảo lý thuyết cho cơ chế phân tử của quá trình chết theo chương trình do nhiễm ký sinh trùng gây ra.
Th.S Chinh Lê
Học viện Nông nghiệp Việt Nam
English